禽流感通用/H5亞型(AIV-U/H5)熒光PCR試劑盒說明書
【產(chǎn)品名稱】
商品名稱:禽流感通用/H5亞型(AIV-U/AIV-H5)?核酸檢測(cè)試劑盒(實(shí)時(shí)熒光-PCR法)
Name :Avian influenza universal/H5 subtype (AIV-U/AIV-H5) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence-PCR)
【包裝規(guī)格】48T/盒
【預(yù)期用途】
禽流感是由A型流感病毒所引起的禽類疾病。禽流感通用/H5亞型(AIV-U/AIV-H5)除了感染禽類外,部分亞型也能夠引起人感染或發(fā)病。野生水禽是禽流感病毒的自然宿主,一般對(duì)其不致病,當(dāng)它們傳染給其它物種時(shí)有時(shí)會(huì)造成大的發(fā)病率和死亡率。
本試劑盒適用于檢測(cè)標(biāo)本中的禽流感通用/H5亞型(AIV-U/AIV-H5),適用于禽流感通用/H5亞型(AIV-U/AIV-H5)?感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒分別對(duì)禽流感AIV-U和H5?設(shè)計(jì)特異性的引物和探針,用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)AIV-U/H5 RNA進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)。
【試劑組成】
名 稱 規(guī) 格
酶液 50μL×1 管
AIV-H7N9 反應(yīng)液 1.0mL×1 管
AIV-H7N9 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管
陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管
注:
1)不同批號(hào)試劑不能混用。
2)試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測(cè)次數(shù)。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 7 次,有效期 9 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 系列 、安捷倫 MX3000P/3005P 、MJ Opticon2 、Eppendorf 2/4 Color Systems、Bio-RadCFX96 等熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
病死或撲殺禽,取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織;待檢活禽,用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物,置于 1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個(gè)月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1.樣品處理(樣本處理區(qū))
1.1樣本前處理
每份組織分別從 3 個(gè)不同的位置稱取樣品約 1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中, 8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中;棉拭子直接取 100 μL 提取。
1.2RNA 提取
推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 RNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請(qǐng)按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
2.試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽性對(duì)照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:
試劑 AIV-H7N9 反應(yīng)液 酶液
用量 20μL 1μL
將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21uL/管。
3.加樣(樣本處理區(qū))
將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
4.PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);
4.2
設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;熒光通道選擇: 檢測(cè)通道
(Reporter Dye)FAM、CY5, 淬滅通道(Quencher Dye)選擇 NONE,ABI 系列儀器請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:
步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時(shí)間 收集熒光信號(hào)
1 1cycle 42℃ 20min 否
2 1 cycle 95℃ 10min 否
3 40 cycle 94℃ 15sec 否
55℃ 30sec 是
5.結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
FAM 通道為禽流感病毒 H7N9 亞型 H7 基因檢測(cè)結(jié)果,CY5 通道為禽流感病毒H7N9 亞型 N9 基因檢測(cè)結(jié)果
陽性:檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。
可疑:檢測(cè)通道 Ct 值>35.0,且出現(xiàn)明顯擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn) Ct 值≤35.0 和明顯擴(kuò)增曲線者為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果無 Ct 值且無明顯的擴(kuò)增曲線。
6.檢測(cè)方法的局限性
樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);
樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果;
陽性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果;
病原體在流行過程中基因突變、重組,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
不同的提取方法存在提取效率差異,會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果;
試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降,出現(xiàn)假陰性或定 量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果;
本檢測(cè)結(jié)果僅供參考,如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
7.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線且無 Ct 值顯示;
陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
【參考文獻(xiàn)】
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[3]徐曉龍, 包紅梅, 馬 勇, 等. H7 和 N9 亞型及 A 型流感病毒多重?zé)晒?RT-PCR 檢測(cè)方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 12, 36: 939-942.
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